全长转录组测序

技术简介

基于Pacbio单分子实时测序技术（Single Molecule Real-Time Sequencing，SMRT），借助其超长读长优势，无需组装，直接获得从5’末端到3’PolyA尾的高质量的全长转录本信息。利用全长转录组测序，可获取全长mRNA序列，对基因异构体、可变剪切、融合基因进行准确鉴定。

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 案例分析

全长转录组测序揭秘玉米转录组的复杂性[1]

研究背景

玉米（Zea mays）是全球重要的农作物，也是研究植物转录组代谢通路的遗传模型。玉米基因组序列于2009年公布，后续利用EST和RNA-Seq转录组数据对其基因注释进行了补充。然而RNA-Seq中，短读长无法提供转录本全长序列，限制了可变剪接形式的鉴定等。

研究方法

采集玉米自交系B73不同发育阶段的6个组织（根、花粉、胚芽、胚乳、幼雌穗、幼雄穗），提取mRNA，构建6种插入片段文库（<1, 1–2, 2–3, 3–5, 4–6 和>5 kb），进行全长转录组测序和二代RNA-Seq测序（每个样品三个重复）。

图1. 新鉴定LncRNA分析

研究结果

测序得到的全长转录本序列，其中有94.2%能够比对到玉米RefGen_v3参考基因组上。经聚类分析得到了来自53个家族（RefGen_v3总共57个）的新的isoform，对应26,943个基因，转录因子5,423个，其中155个与生长激素应答功能相关。而鉴定的878个候选LncRNA中，867个（平均读长为1.1kb）为新发现的LncRNA，具有结构和组织特异性。进一步对isoform、lncRNA和non-lncRNA区域进行甲基化分析，发现non-lncRNA genes具有相对较高的CG甲基化水平，而lncRNAs具有相对较高的CHG甲基化水平，这些甲基化水平可能与玉米不同组织中基因的不同表达水平有关。

研究结论

PacBio超长读长无需组装即可得到全长转录组信息，相比于Illumina短读长组装的isoform而言，更能直接准确地获得isoform信息，有助于解密玉米转录组复杂的基因表达信息。

参考文献

[1]. Wang B, Tseng E, Regulski M, et al. Unveiling the complexity of the maize transcriptome by single-molecule long-read sequencing[J]. Nature Communications, 2016, 7:11708.